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蒺藜總黃酮提取工藝的研究
【摘要】 目的研究蒺藜總黃酮最佳提取工藝條件。方法采用正交實(shí)驗(yàn)，以提取物中總黃酮的含量作為考察指標(biāo)，優(yōu)選出最佳提取工藝。結(jié)果蒺藜總黃酮的最佳提取工藝條件為：提取時(shí)間1.5 h，提取溫度70～75℃，乙醇濃度70%，料液比1∶15(g/ml)，按照最佳提取工藝條件提取蒺藜全草中的總黃酮，含量可達(dá)7.152 mg/g。結(jié)論實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的4因素中，提取時(shí)間對(duì)結(jié)果有極顯著的影響，提取溫度對(duì)結(jié)果有顯著的影響，乙醇濃度和料液比對(duì)結(jié)果影響不顯著。
【關(guān)鍵詞】 正交實(shí)驗(yàn); 蒺藜; 總黃酮; 紫外分光光度法
蒺藜Tribulus terrestrisl L.為蒺藜科(Zypophyllaceae) 一年生草本植物，廣布全國(guó),習(xí)稱(chēng)硬蒺藜。蒺藜全草含有皂苷類(lèi)、黃酮類(lèi)、氨基酸類(lèi)及糖類(lèi)等成分[1,2]，在心血管系統(tǒng)及強(qiáng)壯、抗衰老、增強(qiáng)性功能等方面表現(xiàn)較強(qiáng)的活性[3～5]。研究發(fā)現(xiàn)蒺藜中黃酮類(lèi)的含量是皂苷含量的1.5倍左右，所含黃酮類(lèi)化合物的苷元主要為槲皮素(Quercetin)、山萘酚(Kaempferol)及異鼠李素(Isorhamnetin)，且以槲皮素為母核的黃酮類(lèi)成分含量最高[6]。蒺藜總黃酮提取工藝的研究尚未報(bào)道。本研究采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)影響蒺藜總黃酮提取的因素進(jìn)行了研究，為獲得其最佳提取工藝條件提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1 材料與儀器
1.1 供試植物蒺藜植物材料于2006?07采自寧夏鹽池縣，由寧夏大學(xué)生命學(xué)院植物教研室陳彥云教授鑒定為蒺藜科蒺藜屬蒺藜Tribulus terrestrisl L.。樣品采集后自然條件下陰干，用萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎后過(guò)40目篩,儲(chǔ)存于陰暗、干燥處。
1.2 試劑蘆丁對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所);無(wú)水乙醇、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH等試劑均為分析純。
1.3 儀器TU-1810DSPC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Buchi，瑞士)、SHZ-D循環(huán)水式真空泵(河南鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)、電熱恒溫水浴鍋HH.S11-2(北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠)。
2 方法
2.1 樣品提取精密稱(chēng)取蒺藜粉末2 g，共計(jì)9份，參照文獻(xiàn)[7,8]，采用L9(34)正交設(shè)計(jì)(見(jiàn)表3～4)回流提取，固定提取次數(shù)為3次，抽濾，合并3次濾液，減壓蒸餾，回收乙醇，將提取液用無(wú)水乙醇定容于100 ml容量瓶中，搖勻，作為待測(cè)原溶液。各取上述待測(cè)原溶液5 ml，精密測(cè)定，置25 ml容量瓶中，加適量無(wú)水乙醇超聲溶解，稀釋至刻度，搖勻，靜置。取上清液5.0 ml置蒸發(fā)皿中，加入2.0 g聚酰胺粉吸附，于50℃水浴中揮去乙醇，然后轉(zhuǎn)入層析柱，先用25 ml石油醚洗脫，棄去洗脫液，再用無(wú)水乙醇洗脫，收集洗脫液(至鹽酸-鎂粉反應(yīng)為陰性)，置25 ml容量瓶中，加無(wú)水乙醇至刻度，作為待測(cè)樣品溶液。
2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密稱(chēng)取在120℃干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg，用無(wú)水乙醇溶解，定容至100 ml，得濃度為50 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)液。分別精密吸取上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml置于10 ml容量瓶中，分別加5%亞硝酸鈉0.3 ml，放置6 min，再加10%硝酸鋁0.3 ml，放置6 min，加4%氫氧化鈉4 ml，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，放置15 min后，在分光光度計(jì)上于510 nm處測(cè)定其吸光度，無(wú)水乙醇為空白參比。以吸收度A為縱坐標(biāo)，濃度C為橫坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析，繪制回歸曲線。結(jié)果在0～5 μg/ml的范圍內(nèi)，濃度與吸光度有良好的線性關(guān)系。得出回歸方程：A=0.064 9C+0.001 2(C:μg/ml)，r=0.999 8。
2.3 樣品總黃酮含量測(cè)定精密吸取上述待測(cè)樣品溶液1.0 ml，分別置10 ml容量瓶中，按照“2.1.2”項(xiàng)下的方法，在510 nm下測(cè)定其吸光度A，按回歸方程計(jì)算出提取物中的總黃酮含量。
2.4 方法學(xué)考察
2.4.1 精密度考察精確稱(chēng)取樣品粉末約2 g，按照待測(cè)樣品制備方法制備待測(cè)樣品溶液，準(zhǔn)確吸取待測(cè)溶液1.0 ml,置于10 ml容量瓶中，加蒸餾水定容至10 ml，按“2.1.2”項(xiàng)下的方法，在510 nm下測(cè)定其吸光度A，5次測(cè)定的平均吸光度為0.061 3，RSD為0.67%，說(shuō)明儀器的精密度良好。
2.4.2 穩(wěn)定性研究將上述溶液每隔10 min測(cè)定1次吸光度，5次測(cè)定的平均吸光度為0.066 2，RSD為1.21%(n=5)，表明待測(cè)樣品溶液在1 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.4.3 重復(fù)性考察將上述溶液平行制備5份待測(cè)溶液，測(cè)定其吸光度，5次測(cè)定的總黃酮得率平均為6.3 mg/g，RSD為0.912%，說(shuō)明方法的重復(fù)性好。
2.4.4 加樣回收率實(shí)驗(yàn)分別精密吸取一定量的待測(cè)樣品溶液，按照上述方法測(cè)定其吸光度，計(jì)算回收率，平均回收率為100.73%，RSD為1.35%(見(jiàn)表1)，表明方法的回收率較好表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)已知樣品量m/g加入對(duì)照品量m/g測(cè)定量m/g回收率(%)平均回收率(%)
3 結(jié)果
3.1 總黃酮提取方法的選擇浸泡法：取蒺藜粉末2 g，用15倍量的80%乙醇浸泡3次，2 h/次，抽濾，合并濾液回流法：取蒺藜粉末2 g，用15倍量的80%乙醇提取3次，2 h/次，抽濾，合并濾液。用以上兩種提取方法提取蒺藜總黃酮，依次測(cè)定其中總黃酮含量，得出回流法提取總黃酮的含量最高為6.612 mg/g，其次是浸泡法為5.263 mg/g。故選用回流法作為蒺藜總黃酮的提取方法，并通過(guò)下面正交實(shí)驗(yàn)選擇最佳提取條件。
3.2 總黃酮提取的正交實(shí)驗(yàn)在選擇回流作為提取方法的基礎(chǔ)上，擬定乙醇濃度、乙醇用量、提取溫度、提取時(shí)間作為考察因素，每個(gè)因素取3個(gè)水平，固定提取次數(shù)為3次，選用L9(34)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。因素水平見(jiàn)表2，以提取物中總黃酮的得率為考察指標(biāo)。結(jié)果見(jiàn)表3 對(duì)于總黃酮的提取，通過(guò)直觀分析，B因素影響不顯著，故以B因素作為誤差進(jìn)行方差分析。結(jié)果見(jiàn)表4。根據(jù)表2和表3可以看出料液比、乙醇濃度對(duì)指標(biāo)影響不顯著，提取溫度對(duì)指標(biāo)有顯著性影響(P<0.05)，提取時(shí)間對(duì)指標(biāo)有極顯著的影響 3.3 最佳提取條件的驗(yàn)證按照上述確定的最佳條件，做5次平行實(shí)驗(yàn)，得出總黃酮的含量比正交實(shí)驗(yàn)中的任何一次實(shí)驗(yàn)的含量都高，平均為7.152 mg/g，RSD為0.646%。這就進(jìn)一步說(shuō)明了正交實(shí)驗(yàn)所得到的上述最佳條件為蒺藜總黃酮提取的較為理想的工藝表2 因素水平 表3 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以及結(jié)果表4 方差分析
4 討論
基于回流提取方法，設(shè)計(jì)了較為合理的4因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)，選用了4種因素，研究對(duì)蒺藜中總黃酮提取的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明回流提取技術(shù)與傳統(tǒng)的浸泡相比較具有提取時(shí)間短、總黃酮得率高等優(yōu)點(diǎn)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終確定提取工藝如下：取粉碎的蒺藜粉末適量，提取時(shí)間為1.5 h,乙醇濃度為70%,提取溫度為70～75℃,料液比為1∶15(g/ml)。
本研究選用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，大大提高了蒺藜中總黃酮的提取效率。為蒺藜中黃酮類(lèi)化合物的深入研究和為蒺藜藥用成分的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。
【參考文獻(xiàn)】
[1] 蔡利鋒，景鳳英，張建國(guó)，等.蒺藜化學(xué)成分的研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，1999, 34(10): 759.
[2] Dragomir Dinchev ,Bogdan Janda ,Liuba Evstatieva, et al. Distribution of steroidal saponins in Tribulus terrestris from diferent geographical regions[J].Phytochemistry, 2008, 69: 176.
[3] Oludotun A.Phillips ,Koyippalli T. Mathew, Mabayoje A.Oriowo. Antihypertensive and vasodilator effects of methanolic and aqueous extracts of Tribulus terrestris in rats[J].Journal of Ethnopharmacology , 2006,104: 351.
[4] 吳恩融，馮 建，立北齡，等.蒺藜皂甙抗衰老作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2000,35(2): 49.
[5] 張秀琴，徐 舉，金春花，等.蒺藜莖葉總皂甙的強(qiáng)壯作用[J].中成藥研究, 1987,17(9): 45.
[6] 師 勤，余伯陽(yáng)，徐珞珊，等.反高效液相色譜法測(cè)定蒺藜類(lèi)3種水解黃酮甙元的含量[J].藥物分析雜志，1999, 19(2): 75.
[7] 吳瓊詩(shī).蒺藜全草中總黃酮的含量測(cè)定[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，1998, 14(4): 273.
[8] 孫敏耀，唐文照，盧 霞，等.分光光度法測(cè)定不同采收時(shí)間桑葉中總黃酮[J].中草藥, 2004, 35 (10): 1098.
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