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喉疾靈口含片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究
【摘要】 目的研究喉疾靈口含片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法 采用薄層色譜(TLC)法對喉疾靈口含片中人工牛黃、訶子、了哥王、冰片、桔梗進(jìn)行定性鑒別;采用高效液相色譜(HPLC)法進(jìn)行苦參堿含量測定。結(jié)果 TLC法能分別檢出喉疾靈口含片中人工牛黃、訶子、了哥王、冰片、桔梗，均具有良好的鑒別特征，陰性未見干擾;苦參堿在0.066 8～0.668 μg范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積具有良好的線性關(guān)系， r=0.999 8，平均加樣回收率為98.86%(n=6)，RSD=1.94%。 結(jié)論 本方法具有良好的專屬性和重現(xiàn)性，能準(zhǔn)確、穩(wěn)定地對喉疾靈口含片進(jìn)行定性鑒別和定量測定，可用于該制劑的質(zhì)量控制。
【關(guān)鍵詞】 喉疾靈口含片;TLC法;HPLC法;苦參堿
Abstract:ObjectiveTo study on the quality standard of Houjiling buccal tablets.Methods Thin layer chromatography (TLC) was used to identify Calculus Bovis Artifactus,Indian Stringbush Root,Medicine Terminalia Fruit,Borneol and Balloonflower Root,and HPLC was applied to assay matrine.Results Calculus Bovis Artifactus,Indian Stringbush Root,Medicine Terminalia Fruit,Borneol and Balloonflower Root can be identified by TLC without interference of negative samples.It showed a good linear relationship in determining matrine at the range of 0.066 8-0.668 μg, r=0.999 8,and the average recovery was 98.86%(RSD=1?94%).Conclusion These methods can be used in qualitative identification and quantitative assay of Houjiling buccal tablets with good specificity,reproducibility and stability.
Key words:Houjiling buccal tablets; TLC; HPLC; matrine
喉疾靈口含片是由喉疾靈膠囊[1]經(jīng)過提取精制和劑型改變而成，由人工牛黃、訶子(肉)、山豆根等12味中藥材組成，具有清熱、解毒、散腫止痛作用，用于腮腺炎、扁桃體炎、急性咽炎、慢性咽炎急性發(fā)作及一般喉痛等。為了更好控制喉疾靈口含片質(zhì)量，保證其用藥安全有效，筆者參照文獻(xiàn)[2-5]對口含片中人工牛黃、訶子、了哥王、冰片、桔梗等進(jìn)行了薄層色譜研究，建立其定性鑒別方法，并參照文獻(xiàn)[6-9]采用高效液相色譜法建立該制劑主藥山豆根所含主要有效成分苦參堿的含量測定方法，并對3批中試樣品進(jìn)行含量測定。現(xiàn)報道如下。
1儀器與試藥
1.1儀器
Agilent1100高效液相色譜儀系列(美國安捷倫公司)、BP211D電子分析天平(德國Sartorius公司)、CAMAG REPROSTAR 3數(shù)碼成像系統(tǒng)(瑞士CAMAG)、H·S·G·ⅡB-4型電熱恒溫水浴鍋(上海儀表供銷公司)、KQ3200超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司，功率120 W，頻率40 kHz)、硅膠 G預(yù)制板(浙江臺州市路橋四甲生化塑料廠)，定量毛細(xì)管(Drummond USA)。
1.2試藥
喉疾靈口含片(批號：20070501、20070502、20070503)由陳李濟(jì)藥廠提供，苦參堿對照品(批號:110805-200306)、沒食子酸對照品(批號：110831-200302)、人工牛黃對照藥材(批號:121197-200502)、 桔梗對照藥材(批號:121028-200507)、了哥王對照藥材(批號:1266-0301)、冰片對照藥材(批號:110742-200504)等均由中國藥品生物制品檢定所提供，水為三蒸水，其他試劑均為分析純。
2定性鑒別
2.1人工牛黃TLC鑒別
取本品6片，研細(xì)，稱取2.4 g，加甲醇10 mL，超聲處理10 min，濾過，濾液濃縮至2 mL，作為供試品溶液。取人工牛黃對照藥材，加甲醇使溶解，制成每1 mL含10 mg的溶液，作為對照藥材溶液。另按處方工藝制備缺人工牛黃的陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制備陰性對照溶液。按《中國藥典》2005年版一部附錄ⅥB 薄層色譜法試驗，精密吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(體積比9∶5∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%(體積分?jǐn)?shù))硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。陰性對照則未見相應(yīng)斑點(diǎn)。見圖1。
2.2了哥王TLC鑒別
取“2.1”項下供試品溶液作為供試品溶液。分別取了哥王原藥材、了哥王對照藥材各0.5 g，同供試品溶液制備方法制備了哥王原藥材及對照藥材溶液。另按處方工藝制備缺了哥王的陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制備陰性對照溶液。按《中國藥典》2005年版一部附錄ⅥB薄層色譜法試驗，精密吸取上述4種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯-甲酸(體積比6∶5∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材、原藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯藍(lán)色熒光斑點(diǎn)。陰性對照則未見相應(yīng)斑點(diǎn)。見圖2。[PSd171;S*2〗1.人工牛黃對照藥材; 2～4.供試品; 5.陰性對照圖1人工牛黃TLC圖Figure 1TLC chromatogram of Calculus Bovis Artifactus[PSd172;S*2〗1.了哥王對照藥材; 2.了哥王原藥材; 3～5.供試品;6.陰性對照圖2了哥王TLC圖Figure 2TLC chromatogram of Indian Stringbush Root
2.3訶子TLC鑒別
取“2.1”項下供試品溶液作為供試品溶液。取訶子肉原藥材0.5 g，同供試品溶液制備方法制備原藥材溶液。取沒食子酸對照品適量，加乙醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液，作為對照品溶液。另按處方工藝制備缺訶子肉的陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制備陰性對照溶液。按《中國藥典》2005年版一部附錄ⅥB薄層色譜法試驗，精密吸取上述4種溶液各3 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(體積比7∶5∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%(質(zhì)量濃度)三氯化鐵乙醇溶液，置可見光下檢視。供試品色譜中，在與對照品、原藥材相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。陰性樣品則無相應(yīng)斑點(diǎn)。見圖3。[PSd173〗1.沒食子酸對照品;2.訶子原藥材;3～5.供試品;6.陰性對照圖3訶子TLC圖Figure 3TLC chromatogram of Medicine Terminalia Fruit
2.4冰片TLC鑒別
取本品10片，研細(xì)，過100目篩，稱取粉末3 g，用無水乙醚振搖洗滌5次，每次20 mL，棄去乙醚液，殘渣揮干乙醚，加甲醇20 mL超聲處理10 min，濾過，濾液蒸干，用乙酸乙酯20 mL超聲溶解，濾過，濾液蒸干，加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。取冰片對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。另按處方工藝制備缺冰片的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照溶液。按《中國藥典》2005年版一部附錄ⅥB 薄層色譜法試驗，精密吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(體積比10∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%(質(zhì)量濃度)磷鉬酸無水乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置可見光下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。陰性對照未見對應(yīng)斑點(diǎn)。見圖4。[PSd174;S*2〗1.冰片對照品; 2～4.供試品; 5.陰性對照 圖4冰片TLC圖Figure 4TLC chromatogram of Borneol
2.5桔梗TLC鑒別
取本品10片，研細(xì)，稱取5 g，加7%(體積分?jǐn)?shù))硫酸乙醇-水(體積比1∶3)混合液20 mL，加熱回流提取3 h，放冷，用三氯甲烷振搖提取3次，每次20 mL，合并三氯甲烷液，加水30 mL洗滌，棄去洗滌液，三氯甲烷液用無水Na2SO4脫水，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1mL使溶解，作為供試品溶液。取桔梗對照藥材1.5 g，同法制備對照藥材溶液。另按處方工藝制備缺桔梗的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照溶液。按《中國藥典》2005年版一部附錄ⅥB 薄層色譜法試驗，精密吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-冰乙酸-水(體積比1.5∶1.5∶1∶1)上層液為展開劑，飽和30 min，展開，取出，晾干，噴以10%(體積分?jǐn)?shù))硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置可見光下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的的斑點(diǎn)。陰性樣品則未見相應(yīng)斑點(diǎn)。結(jié)果見圖5。[PSd175;S*2〗1.桔梗對照藥材; 2～4.供試品; 5.陰性對照圖5桔梗TLC圖Figure 5TLC chromatogram of Balloonflower Root
3含量測定
參考相關(guān)文獻(xiàn)[6-9]，建立了喉疾靈口含片中苦參堿的含量測定方法。
3.1色譜條件
色譜柱：Agilent C18 (4.6 mm×150 mm，5 μm);流動相：0.4%(體積分?jǐn)?shù))三乙胺乙腈-0.2%(體積分?jǐn)?shù))磷酸水溶液(體積比7∶93);檢測波長：202 nm;流速：0.5 mL·min -1。
3.2對照品溶液的制備
精密稱取苦參堿對照品適量，置量瓶中，加水使完全溶解，制成每1 mL中含苦參堿66.8 μg的溶液，作為對照品溶液。
3.3供試品溶液的制備
取本品10片，研細(xì)，取約2 g,精密稱定，精密加入稀氨水(1→10)25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min使溶解，放冷，再稱定質(zhì)量，用水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液2 mL，置中性氧化鋁柱(100～200目，5 g，內(nèi)徑1 cm)上，用氨水飽和的乙酸乙酯50 mL洗脫。收集全部洗脫液，蒸干，殘渣用無水乙醇1 mL超聲溶解，再用少量水超聲洗滌多次，全部合并置5 mL量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。
3.4缺山豆根陰性對照溶液的制備
按處方工藝制備缺山豆根陰性樣品，稱取2 g，按“3.3”項下方法制備，即得。
3.5系統(tǒng)適應(yīng)性試驗
分別精密吸取對照品、供試品、缺山豆根陰性對照溶液各10 μL，按“3.1”項條件進(jìn)樣。在該色譜條件下，苦參堿與其他成分可達(dá)基線分離，苦參堿保留時間約為6.7 min，理論塔板數(shù)不低于3 000，各成分分離度均大于1.5;陰性對照無干擾。見圖6。[PSd176;S1〗A.苦參堿對照品; B.供試品; C.缺山豆根陰性對照圖6苦參堿的HPLC圖Figure 6HPLC chromatograms of matrine
3.6方法學(xué)考察
3.6.1線性范圍的考察分別精密吸取苦參堿對照品溶液 1、2、4、8、10 μL依次進(jìn)樣，按“3.1”項下條件測定峰面積，以苦參堿進(jìn)樣量(X)對峰面積(Y)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=4.2205×10-3X+22.697，r=0.999 8。結(jié)果顯示，苦參堿進(jìn)樣量在0.066 8～0.668 μg范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系。
3.6.2精密度試驗精密吸取供試品溶液(20070501)10 μL，連續(xù)測定6次，測定峰面積，計算含量。結(jié)果苦參堿平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.579 9 mg·g-1，RSD為0.13%，表明儀器精密度良好。
3.6.3穩(wěn)定性試驗精密吸取同一批號(20070501) 供試品溶液，按“3.1”項下色譜條件，分別于0、5、6.5、8、9、12 h 進(jìn)樣10 μL，測定峰面積，計算含量。結(jié)果苦參堿平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.579 0 mg·g-1，RSD為0.27%，表明苦參堿在12 h內(nèi)穩(wěn)定。
3.6.4重復(fù)性試驗取同一批樣品(20070501)按“3.3”項下方法制備供試品溶液，平行操作6份，按“3.1”項下色譜條件，測定峰面積并計算含量。結(jié)果苦參堿平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.576 4 mg·g-1，RSD為1.31%，表明重復(fù)性良好。
3.6.5加樣回收率試驗取已知含量的同一批號(20070501)喉疾靈口含片(約相當(dāng)于苦參堿0.574 0 mg·g-1)適量，研細(xì)，取6份，每份約1 g，精密稱定，分別置25 mL量瓶中，再分別加入苦參堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.022 mg·mL-1對照品溶液(精密稱取苦參堿對照品5.11 mg，置5 mL量瓶中，加水使完全溶解并定容至刻度)0.5 mL，按“3.3”項下方法制備供試品溶液，按“3.1”項下色譜條件測定，計算苦參堿回收率，見表1。
3.7樣品含量測定
取3批中試樣品(20070501、20070502、20070503)，分別按照“3.3”項下方法制備供試品溶液，每批平行操作3份。分別精密吸取各供試品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，按“3.1”項下條件測定，計算苦參堿含量。結(jié)果3批中試樣品中苦參堿含量分別為0.357 4、0.420 7、0.383 6 mg·片-1。
4討論
4.1定性鑒別中藥材的選擇
在原喉疾靈膠囊(國家部頒標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)編號：WS3—B—1039—91)和喉疾靈片(部頒標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)編號：WS3—B—2797—97)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上結(jié)合《中國藥典》2005年版一部中相關(guān)藥材標(biāo)準(zhǔn)，對喉疾靈口含片進(jìn)行了系統(tǒng)研究，旨在提高其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。本研究用無毒或低毒溶劑替換毒性較大的溶劑，如用二氯甲烷替換三氯甲烷等，可提高試驗安全性。方中人工牛黃、了哥王、冰片、桔梗、訶子的TLC鑒別均具有明顯的特征斑點(diǎn)，且陰性未見干擾;而連翹、天花粉、豬牙皂、板藍(lán)根等藥材雖具相應(yīng)的鑒別特征，但重現(xiàn)性均較差，故暫未列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，擬在下一步試驗中進(jìn)行研究。山豆根藥材雖也有專屬鑒別特征，但其所含特征性成分苦參堿已列入定量檢測項中，故不選作定性鑒別。表1加樣回收率試驗結(jié)果
4.2含量測定指標(biāo)的確定
方中山豆根為主藥，具有清熱解毒、利咽散腫作用[2]，苦參堿、氧化苦參堿為其主要有效成分。本方中山豆根采用水提工藝，氧化苦參堿經(jīng)水煎煮后轉(zhuǎn)化為苦參堿[6-7]，故本文只選擇了苦參堿作為喉疾靈口含片質(zhì)量控制的指標(biāo)成分進(jìn)行定量研究。
4.3色譜條件的選擇
對乙腈-水、乙腈-0.2%(體積分?jǐn)?shù))磷酸水、0?4%(體積分?jǐn)?shù))三乙胺乙腈-水和0.4%(體積分?jǐn)?shù))三乙胺乙腈-0.2%(體積分?jǐn)?shù))磷酸水等流動相及其不同配比進(jìn)行了比較，結(jié)果以0.4%(體積分?jǐn)?shù))三乙胺乙腈-0.2%(體積分?jǐn)?shù))磷酸水溶液(體積比7∶93)進(jìn)行洗脫的分析效果較優(yōu)，分析時間短、分離度較高、基線較平穩(wěn)，適用于該制劑的含量分析。
本文所建立的人工牛黃、了哥王、冰片、桔梗、訶子TLC法均具有良好的專屬性和重現(xiàn)性，可用于喉疾靈口含片的藥材定性鑒別;所建立的含量測定方法具有良好的精密度、準(zhǔn)確性和重復(fù)性，專屬性好，測定快速，可用于喉疾靈口含片中苦參堿的含量測定。
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