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持久穩(wěn)定的大鼠→小鼠造血嵌合體模型的建立
作者：武小娟，李春富，唐湘鳳，石磊
【關鍵詞】 骨髓移植
Establishment of stable rat→mouse hematopoietic chimera model
【Abstract】 AIM: To establish a stable animal model of hematopoietic chimerism. METHODS: Conditioned SD rats received bone marrow cells from BALB/c mouse to induce xenogeneic chimeric rats. Thirty days later, lethally irradiated BALB/c mice received bone marrow cells from chimeric rats and their survival rate was monitored daily. Recipients splenic cells were stimulated in mixed lymphocyte culture (MLC) with xenoantigen and skin transplantation was carried out on day 30. RESULTS: Acute graft versus host disease was significantly alleviated, the survival time was prolonged and T cell proliferation was inhibited. More stable xenogeneic chimerism over 90 d was achieved via reverse bone marrow transplantation. CONCLUSION: A longterm xenogeneic chimera model is established by transplanting bone marrow cells of chimeras.
【Keywords】 chimera model; wholebody irradiation; bone marrow transplantation
【摘要】 目的： 建立持久穩(wěn)定的造血嵌合體模型. 方法： 將預處理后的SD大鼠經(jīng)尾靜脈注射BALB/c小鼠骨髓細胞，誘導形成特異性耐受的嵌合體SD大鼠. 30 d后，再將此嵌合體大鼠的骨髓反向移植給致死性照射后的BALB/c小鼠，監(jiān)測小鼠的存活率，移植后30 d做皮片移植和混合淋巴細胞培養(yǎng)，觀察小鼠嵌合率的變化. 結果： 嵌合體模型小鼠僅有輕度移植物抗宿主病的表現(xiàn)，生存期明顯延長，移植后嵌合率較穩(wěn)定，移植皮片存活期延長，與對照組相比有顯著性差異. 結論： 通過輸入嵌合體骨髓的方法可建立穩(wěn)定持久的大鼠→小鼠嵌合體模型.
【關鍵詞】 嵌合體模型；全身照射；骨髓移植
0引言
大鼠→小鼠的骨髓移植，通過對受體進行強烈的清髓性預處理或注射大量骨髓以獲得可靠植活，但異種移植物抗宿主病（XGVHD）較強，且嵌合狀態(tài)隨時間延長逐漸消失. 為建立穩(wěn)定的異種造血嵌合體，我們研究了協(xié)調(diào)性動物（大鼠小鼠）的骨髓移植模型，因為他們之間不存在天然的抗體，對異種移植物不會發(fā)生超急排斥(hyperacute rejection, HAR). 先對供者進行預處理，使其產(chǎn)生對小鼠的特異性耐受，再將此嵌合體大鼠的骨髓反向移植給小鼠. 由于此前嵌合體大鼠已對小鼠產(chǎn)生了特異性耐受，故將此耐受的骨髓植入小鼠體內(nèi)可明顯減輕XGVHD，并誘導出持久穩(wěn)定的嵌合狀態(tài).
1材料和方法
1.1材料
SD大鼠(SPF級)8只，雌性，8～10周齡. C57BL/6(H2b)小鼠6只，雌性，8～10周齡. BALB/c(H2 d)小鼠40只（包括在MLR和病理檢查中處死的小鼠，不編入各組計數(shù)），雌性，8～10周齡，均購自第一軍醫(yī)大學實驗動物中心,并飼養(yǎng)在清潔實驗動物中心層流倉. PE標記的抗小鼠H2DdmAb(PharMingen公司)；FITC標記的抗大鼠MHCCLASSⅠmAb(Serotec公司)；3HTdR（中國原子能研究所）；60Co照射源(廣東省輻照中心)；流式細胞儀（FACScan; Becton Dickinson）；自動液閃計數(shù)器（Beckman, USA）.
1.2方法
1.2.1嵌合體模型的建立SD大鼠于術前5 d開始飲含紅霉素(250 mg/L)和慶大霉素(320 mg/L)的抗生素溶液. 無菌條件下取BALB/c小鼠骨髓細胞,制成單細胞懸液, SD大鼠接受8Gy（照射率0.5 Gy/min）全身照射(TBI)后4 h內(nèi)經(jīng)尾靜脈輸入BALB/c小鼠骨髓細胞2×108/只,48 h后腹腔注射環(huán)磷酰胺50 mg/kg［1］. 30 h后檢測外周血嵌合率為37.39%~47.26%，證實小鼠源性骨髓已在大鼠體內(nèi)植活. 取上述嵌合體SD大鼠骨髓細胞,制成單細胞懸液,BALB/c小鼠腸道凈化后接受9 Gy全身照射，隨即經(jīng)尾靜脈輸入上述嵌合體骨髓細胞4×107/只.
1.2.2實驗分組以BALB/c小鼠為受鼠的A, B, C, D, E組，均接受9 Gy的TBI預處理： A組（8只）輸注正常SD大鼠的骨髓細胞; B組（8只）輸注嵌合體SD大鼠的骨髓細胞;C組（6只）為自體移植組，D組（6只）為預處理組，不輸注骨髓. 以無關第3者B6小鼠為受鼠的E組（6只）輸注嵌合體SD大鼠的骨髓細胞.
1.2.3組織病理檢查出現(xiàn)移植物抗宿主病表現(xiàn)的小鼠,瀕死前活殺,存活者于移植后第60日處死，取其肝、小腸和皮膚標本,以100 mL/L甲醛溶液固定,常規(guī)石蠟包埋、切片,HE染色,光鏡下觀察. 按Thomas GVHD病理組織學分級標準判定［2］.
1.2.4嵌合率的測定取移植后小鼠外周血,加入FITC標記的 抗大鼠MHCCLASSⅠmAb(每1×106細胞中加入1 μg),避光,4℃, 30 min. 紅細胞裂解液去掉紅細胞,PBS洗滌2次,流式細胞儀檢測嵌合率.
1.2.5皮膚移植及存活情況的觀察參考文獻［3］的方法,每日觀察皮毛,如變硬或脫落視為移植排斥,柔軟或鼠毛生長視為移植存活.
1.2.6混合淋巴細胞反應（MLR）移植后30 d，分別取A,B組小鼠與正常BALB/c小鼠的脾細胞為反應細胞，以正常SD大鼠與Whistar大鼠脾細胞為刺激細胞，做混合淋巴細胞反應（MLR），絲裂霉素滅活
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