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納米材料在蛋白磷酸化分析中的應(yīng)用論文
蛋白質(zhì)是生理功能的執(zhí)行者，是生命物質(zhì)的基礎(chǔ)，對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究是生命科學(xué)研究中的重點(diǎn)。翻譯后修飾是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能的重要方式，對(duì)其的研究對(duì)于闡明蛋白質(zhì)的功能具有重要作用。蛋白磷酸化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的一種，是在ATP存在下，通過蛋白激酶催化ATP 位的磷酸基轉(zhuǎn)移到底物蛋白質(zhì)氨基酸上的過程。其在胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、新陳代謝、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)方面具有重要的調(diào)節(jié)作用，是生物體中常見的調(diào)節(jié)方式。當(dāng)其調(diào)節(jié)發(fā)生異常時(shí)，會(huì)導(dǎo)致癌癥、心臟病等疾病的發(fā)生。因此，對(duì)蛋白磷酸化的研究有助于更好地了解細(xì)胞的信號(hào)通路過程，有利于疾病的診斷和治療。然而，由于磷酸化膚段在生物樣品中的含量較低且易受到非磷酸化膚段的干擾等主要缺點(diǎn)的存在，為檢測(cè)工作帶來很大的困難。因此，克服以上瓶頸和困難，實(shí)現(xiàn)蛋白磷酸化的高靈敏檢測(cè)，對(duì)于疾病早期快速診斷具有非常重要的意義。目前，蛋白磷酸化的檢測(cè)方法主要有：放射性檢測(cè)、熒光法、表面等離子體共振、質(zhì)譜、電化學(xué)、WesternBlot及ELISA等。近年來，隨著納米技術(shù)的快速發(fā)展，將納米技術(shù)運(yùn)用于蛋白磷酸化的高靈敏分析受到越來越多的重視。
納米材料按照結(jié)構(gòu)可分為：零維納米材料（包括金屬納米粒子、量子點(diǎn)和磁性納米粒子等）、一維納米材料（如碳納米管等）、二維納米材料（典型代表是石墨烯）。因納米材料大的比表面積、豐富的鍵合位點(diǎn)、良好的生物相容性和催化活性以及獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，為高靈敏、高選擇性生物分析提供了動(dòng)力，在DNA分析酶?jìng)鞲�、生物小分子的檢測(cè)等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，同時(shí)也為蛋白磷酸化分析帶來新的機(jī)遇。
本文基于選擇性識(shí)別或捕獲磷酸化的膚段或蛋白的主要機(jī)理，綜述了近幾年納米材料在磷酸化膚段的富集和信號(hào)放大方面的應(yīng)用，及其在高靈敏蛋白磷酸化分析中的研究進(jìn)展并進(jìn)行了展望。
1磷酸化膚段或蛋白的富集及信號(hào)放大機(jī)理
1。 1基于納米材料的富集機(jī)理
為排除非磷酸化的膚段或蛋白的干擾，選擇性識(shí)別或捕獲磷酸化的膚段或蛋白是非常重要的一步。利用納米材料選擇性富集磷酸化的多膚或蛋白的常見方式是通過化學(xué)親和作用，一種是采用金屬氧化物作親和探針，其中金屬氧化物的路易斯酸度是影響金屬氧化物親和性的主要因素
�、倬哂凶顝�(qiáng)酸度的金屬氧化物，因可與非磷酸化多膚鍵合，致使檢測(cè)存在著很嚴(yán)重的非特異干擾。
�、诰哂休^強(qiáng)酸度的金屬氧化物對(duì)磷酸化膚存在強(qiáng)的鍵合力，因?yàn)槎嗔姿峄w不易洗脫，致使優(yōu)先檢測(cè)單磷酸的多膚。
�、劬哂休^低酸度的金屬氧化物因與單磷酸化膚弱的相互作用，可選擇性地親和多磷酸化的膚。另一種是金屬離子與磷酸根的作用。關(guān)于金屬離子與磷酸根的相互作用存在著爭(zhēng)議，有文獻(xiàn)認(rèn)為金屬離子與磷酸根是靜電吸附作用，而有的文獻(xiàn)則認(rèn)為它們之間作用力的強(qiáng)度遠(yuǎn)大于靜電作用。
1。 2基于納米材料的信號(hào)放大機(jī)理
近幾年，信號(hào)放大技術(shù)尤其是基于納米材料的信號(hào)放大在磷酸化的超靈敏檢測(cè)中受到了廣泛關(guān)注。如何既能選擇性識(shí)別磷酸化膚段或蛋白，又能結(jié)合信號(hào)放大部分，以實(shí)現(xiàn)磷酸化膚段或蛋白檢測(cè)信號(hào)的放大是其關(guān)鍵步驟。較常用的識(shí)別或連接方式主要有兩類：①生物親和作用，②化學(xué)鍵合作用。而基于納米材料信號(hào)放大的機(jī)理主要?dú)w于以下兩個(gè)方面：①納米材料作載體。因?yàn)榧{米材料獨(dú)特的生物相容性和大的比表面積以及易于修飾的特性，使其非常有利于用作載體以增強(qiáng)探針的量。通常納米材料作為一個(gè)基底元素用來富集目標(biāo)分子或信號(hào)分子，以實(shí)現(xiàn)信號(hào)的放大。②增強(qiáng)導(dǎo)電性。一般納米材料的導(dǎo)電性比較優(yōu)越，因此可加快電子傳遞的速率，提高信號(hào)響應(yīng)。
2基于納米材料對(duì)磷酸化膚段或蛋白的預(yù)富集
由于非磷酸化多膚的干擾和磷酸化多膚本身的豐度低等問題，導(dǎo)致研究者對(duì)蛋白磷酸化位點(diǎn)的鑒定和分析存在很大的困難。因此，對(duì)磷酸化的膚段或蛋白進(jìn)行選擇性富集，以提高磷酸化組分的相對(duì)含量，降低非磷酸化組分的干擾顯得十分重要。納米材料及其復(fù)合物因?yàn)閮r(jià)格低，納米表面易于功能化，與磷酸化膚之間的結(jié)合力強(qiáng)，而被廣泛用于蛋白磷酸化的富集和分離。
2。 1介孔納米材料
近幾年，介孔材料在納米科學(xué)領(lǐng)域中占據(jù)重要的地位，基于其獨(dú)特的微納米尺寸效應(yīng)，如大的比表面積、多孔結(jié)構(gòu)等，介孔材料被應(yīng)用于不同的生物領(lǐng)域。
金屬氧化物納米粒子因獨(dú)特的表面效應(yīng)、超順磁性、小尺寸效應(yīng)和量子隧道效應(yīng)等特性，使其表面易于富集磷酸化多膚。早期的研究主要是將單一的納米金屬氧化物填充在柱體中或移液器吸頭內(nèi)進(jìn)行磷酸化膚段的預(yù)富集。2009年，Ge等首次將制備的介孔二氧化錯(cuò)納米材料用于高效選擇性富集磷酸化的膚段。與納米金屬氧化物材料相比，介孔納米材料因其超大比表面積以及許多活性位點(diǎn)，而具有更強(qiáng)的鍵合磷酸根的能力。隨后，介孔二氧化欽和介孔二氧化鉛納米材料也被用于磷酸化膚的富集。研究表明，介孔二氧化鉛和二氧化錯(cuò)在復(fù)雜樣品中富集磷酸化膚段的能力優(yōu)于介孔二氧化欽納米材料。雖然，介孔金屬氧化物納米材料在富集磷酸化多膚方面優(yōu)于金屬氧化物材料，但其過深的孔道結(jié)構(gòu)可能導(dǎo)致目標(biāo)多膚富集和釋放困難。
在己報(bào)道的富集技術(shù)中更傾向于單磷酸化膚段的富集，而導(dǎo)致多磷酸化膚段的信息丟失，不利于對(duì)其全面的了解和研究。針對(duì)這個(gè)問題。用ZrP修飾的介孔硅材料選擇性捕獲磷酸化的膚段并運(yùn)用質(zhì)譜進(jìn)行分析。該材料因表面與多磷酸化膚段的結(jié)合力更強(qiáng)而優(yōu)先富集多磷酸化的膚段。劉寶紅課題組也將功能化的介孔材料應(yīng)用于多磷酸化膚的富集，發(fā)展了新型的針對(duì)多磷酸化膚段的富集方法，該研究組用濕潤(rùn)注入法在硅介孔材料表面修飾二氧化欽，制備了一種基于二氧化欽修飾的介孔硅材料。介孔材料大的比表面積及其良好的微納尺寸效應(yīng)，加快了溶液體系中介孔材料和多膚之間的吸附。同時(shí)又因?yàn)槎趸瘹J修飾于介孔材料之后，在其表面形成大量的不飽和的4配位欽物種，易與磷酸基團(tuán)形成雙齒鰲合，且更傾向于發(fā)生在多磷酸化膚段中，使多磷酸化膚段優(yōu)先選擇吸附，檢測(cè)信號(hào)顯著提高。該研究組還構(gòu)建了一種微納反應(yīng)器，先制備大孔有序的氧化鋁功能化的氧化硅泡沫材料，然后將蛋白酶固定在該泡沫材料上，該反應(yīng)器己被應(yīng)用于磷酸化多膚的分析。具有大的孔徑和比表面積，既可實(shí)現(xiàn)原位酶解又可發(fā)生原位磷酸化。將A1 — MOSF直接加入到溶液中時(shí)，酶和蛋白質(zhì)會(huì)迅速富集到孔穴中以達(dá)到蛋白質(zhì)的快速水解，同時(shí)又吸附固定磷酸化的多膚在其孔穴中，而非特異性的膚段被釋放到溶液中。該方法簡(jiǎn)單、有效，己被成功應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。但以上方法存在一定的局限性，如修飾的金屬氧化物不能完全覆蓋硅基底材料，致使其富集過程受到影響。
2。 2磁性納米材料
為了簡(jiǎn)單快速有效地實(shí)現(xiàn)分離富集，研究者又將具有磁性的鐵氧化物材料引入其中。利用不同的鐵氧化物表面包覆一層TiOZ或AlZ03，用于磷酸化膚段的富集并檢測(cè)。研究表明，由于通過TiOZ包覆的磁性粒子對(duì)樣品進(jìn)行富集后，一些非磷酸化的膚段在譜線中出現(xiàn)，從而對(duì)磷酸化膚段的檢測(cè)產(chǎn)生了干擾Czi —zzl，因此，AlZ 03包覆的磁性粒子對(duì)磷酸化膚的選擇性優(yōu)于TiOZ包覆的磁性粒子。在合成方法中，核殼技術(shù)也越來越多的引起人們的關(guān)注。X等利用水熱反應(yīng)首先合成了Fe 3 0、微球，隨后通過葡萄糖的聚合作用和碳化作用使其表面包覆一層碳，制備了具有核殼結(jié)構(gòu)的Fe304。在此基礎(chǔ)上，制備了介孔核殼結(jié)構(gòu)的磁性納米復(fù)合物，應(yīng)用于磷酸化多膚的分析中，具有高效、特異識(shí)別以及低分子膚段丟失量小的特點(diǎn)Czal 金屬離子修飾的細(xì)菌性磁性納米粒子（BMPs）可用于快速富集檢測(cè)磷酸化的膚段。其中修飾的BMPs優(yōu)先富集單磷酸化的膚段，而Zr4修飾的BMPs則優(yōu)先富集多磷酸化的膚。 2013年，Wang等首次合成了磁性介孔納米晶體簇，無需任何修飾直接用于磷酸化膚段的有效富集。該磁性介孔納米晶體簇具有優(yōu)秀的磁性響應(yīng)（與之前的磁性復(fù)合物相比，磁性分離響應(yīng)時(shí)間少于5s）、超高的選擇性、較高的富集回收率（高于89。4% ）、優(yōu)秀的富集速度（10 min便可完全富集）等特點(diǎn)。該材料己成功應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。
熒光方法因操作簡(jiǎn)單、易讀、高產(chǎn)、樣品量少等獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，近年來在磷酸化富集檢測(cè)中也有相關(guān)應(yīng)用。制備Zr4功能化的磁性納米粒子用于選擇性捕獲磷酸化的具有熒光標(biāo)記的膚段，然后運(yùn)用磁性分離富集，依據(jù)溶液中的熒光強(qiáng)度的改變，對(duì)磷酸化的膚段進(jìn)行分析，利用該材料研究了在不同含量的藥物刺激下，MCF 7細(xì)胞裂解液中蛋白激酶的表達(dá)水平。近期，Liu等制備了TiOZ修飾的磁性微球用于富集磷酸化的膚，與其它熒光方法相比，該材料展現(xiàn)出超高的熒光信號(hào)變化（S IN = 42 ），檢出限低至0。 1U/mL。采用熒光方法結(jié)合磁性納米材料富集目標(biāo)多膚，具有靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)勢(shì)，但同時(shí)也存在需要對(duì)底物進(jìn)行較為復(fù)雜的熒光修飾等缺點(diǎn)。
2。 3碳納米材料
在磷酸化多膚的富集過程中，早期主要用CIA硅膠柱和C — 60共價(jià)鍵合的二氧化硅進(jìn)行預(yù)富集隨后，碳微球因其良好的導(dǎo)電性、豐富的官能團(tuán)和熱力學(xué)穩(wěn)定性等被廣泛應(yīng)用到磷酸化多膚的富集中。其中包括TiOZ功能化的膠質(zhì)微球和TiOZ修飾的磁性石墨碳球等。
近期，基于一維碳納米材料碳納米管和二維的石墨烯在磷酸化多膚的富集和分離方面的研究引起了廣泛關(guān)注。Fang等首次將TiOZ—MWNT納米復(fù)合物用于磷酸化多膚的富集和分離，該納米復(fù)合物還成功應(yīng)用于實(shí)際樣品脫脂牛奶水解液中磷酸化多膚的富集。這主要?dú)w功于MWNT大的比表面積、易吸附疏水性物質(zhì)和TiOZ與磷酸化多膚的專一作用。另外，兩者的復(fù)合還避免了單一TiOZ納米粒子的聚沉等問題。與碳納米管相比，石墨烯是新發(fā)現(xiàn)的具有二維結(jié)構(gòu)的材料，其共扼結(jié)構(gòu)大、電子傳輸能力強(qiáng)、合成原料價(jià)格低廉等優(yōu)勢(shì)，使得石墨烯及其衍生物的應(yīng)用研究成為熱點(diǎn)。金屬氧化物納米粒子功能化的石墨烯復(fù)合物既結(jié)合了金屬納米粒子的特性又繼承了石墨烯的優(yōu)勢(shì)，在磷酸化分析中具有很強(qiáng)的吸引力。但合成的碳納米材料一金屬親和材料中，金屬納米材料的比表面積可能無單一納米微球的比表面積大，致使其選擇性不太理想。
3基于納米材料的信號(hào)放大作用
高靈敏度在發(fā)展新型生物分析方法中己成為主要目標(biāo)，為了滿足對(duì)超靈敏生物傳感器的需求和符合微型化生物分析的發(fā)展趨勢(shì)，信號(hào)放大技術(shù)在近幾年引起了人們的廣泛關(guān)注。如，基于納米材料的信號(hào)放大，基于酶的信號(hào)放大，以及基于核酸的信號(hào)放大技術(shù)等。在這些方法中，納米材料因具有加快信號(hào)傳導(dǎo)和提高位點(diǎn)的識(shí)別作用而在信號(hào)放大技術(shù)中得到廣泛應(yīng)用。本文主要綜述了基于三類納米材料的信號(hào)放大在蛋白磷酸化分析中的研究進(jìn)展。
3。 1基于金屬納米粒子
金屬納米粒子因具有良好的光學(xué)、電化學(xué)和催化特性，己成為生物傳感器中一類很有吸引力的材料，近年來對(duì)于金屬納米材料的研究也在不斷地推進(jìn)。其中基于金納米粒子和銀納米粒子的信號(hào)放大在蛋白磷酸化分析方面效果尤為顯著。
AuNPs的合成非常簡(jiǎn)單，用氯金酸作還原劑，在快速攪拌的條件下可合成粒徑大小均一的Au納米粒子，形成穩(wěn)定分散的膠體溶液。合成的AuNPs具有很多良好的特性，在蛋白磷酸化分析中可直接用于信號(hào)放大。Kim等用半肌氨酸修飾的多膚與AuNP、共價(jià)鍵合，使多膚固定在AuNP、的表面，利用AuNPs既可作目標(biāo)分子富集器，又可作信號(hào)增強(qiáng)器的特性，采用二次離子質(zhì)譜成像法成功地用于蛋白激酶活性的無標(biāo)記分析。Kerman等利用生物素與親和素的專一作用將AuNP、組裝到電極上，以AuNPs為標(biāo)記并通過其氧化還原信號(hào)實(shí)現(xiàn)磷酸激酶活性的分析。隨后，該研究組又利用AuNPs與琉基化的磷酸根的專一作用將其組裝到電極表面，用于蛋白磷酸化的分析。以上方法簡(jiǎn)單、直接、易實(shí)現(xiàn)，但因?yàn)橹皇抢媒鸺{米粒子本身的電學(xué)特性實(shí)現(xiàn)蛋白激酶的檢測(cè)，使得檢測(cè)的靈敏度不夠高。本研究組設(shè)計(jì)了一種新型高靈敏電化學(xué)發(fā)光（ECL）生物傳感器，利用AuNPs作為信號(hào)傳導(dǎo)探針催化魯米諾電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，顯著增強(qiáng)魯米諾的ECL信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了蛋白激酶的高靈敏檢測(cè)，同時(shí)該方法還有效避免了ECL反應(yīng)中強(qiáng)氧化劑的使用，具有很好的穩(wěn)定性。
AuNPs大的比表面積，良好的生物相容性，易與琉基或其他生物配體結(jié)合的性質(zhì)使其成為很好的載體，信號(hào)分子或其它活性物質(zhì)在其表面可實(shí)現(xiàn)信號(hào)的放大。利用功能化的AuNPs作為信號(hào)分子的載體，在其上，錯(cuò)離子同時(shí)與磷酸化的多膚連接。基于靜電作用，該載體可吸附大量帶正電荷的，故可通過檢測(cè) （NH3）電量的變化實(shí)現(xiàn)蛋白磷酸激酶的高靈敏檢測(cè)回。在上述研究基礎(chǔ)上。將負(fù)載信號(hào)分子的過程簡(jiǎn)化，直接將功能化的AuNP、通過共價(jià)鍵合的方法負(fù)載半肌氨酸修飾，構(gòu)建了一種新穎的電化學(xué)發(fā)光生物傳感器用于蛋白磷酸化的高靈敏檢測(cè)。以上方法很大程度提高了檢測(cè)的靈敏度，但因?yàn)榭扇苄缘碾娀钚晕镔|(zhì)的引入，使得背景信號(hào)也升高。Wang等為了避免運(yùn)用可溶性的電活性物質(zhì)產(chǎn)生的較高背景，減小信噪比，將AuNP、負(fù)載大量的辣根過氧化酶（HRP）及親和素，利用生物專一性作用將辣根過氧化酶固定在電極上。HRP可催化聯(lián)苯胺的氧化，產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)，經(jīng)AuNPs放大后電化學(xué)信號(hào)可用于磷酸化作用的檢測(cè)。與之前的報(bào)道相比，該傳感器的檢出限低兩個(gè)數(shù)量級(jí)。目前，本研究組仍致力于功能化的AuNPs信號(hào)放大體系用于蛋白激酶的活性檢測(cè)及其抑制劑的研究：第一個(gè)體系主要是利用AuNPs—DNA中DNA的雜交技術(shù)形成網(wǎng)狀大結(jié)構(gòu)作為載體，負(fù)載豐富的電活性物質(zhì)，以實(shí)現(xiàn)電信號(hào)的顯著增強(qiáng)；第二個(gè)體系是構(gòu)建一個(gè)雙信號(hào)放大的生物傳感器，結(jié)合電化學(xué)發(fā)光技術(shù)高的靈敏性，一方面利用AuNPs催化放大魯米諾的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)，另一方面通過AuNPs表面負(fù)載的多酶催化葡萄糖產(chǎn)生雙氧水，間接催化放大ECL信號(hào)，實(shí)現(xiàn)高靈敏檢測(cè)的目的。
AgNPs的信號(hào)放大作用在靈敏檢測(cè)磷酸化的膚段中也有相關(guān)應(yīng)用。利用T102納米粒子既可充當(dāng)磷酸基團(tuán)特異性鍵合的鍵合劑，又可充當(dāng)感光劑的優(yōu)勢(shì)，在紫外照射下，使得Ag+光催化還原為AgNPs沉積在Ti02納米粒子的表面以實(shí)現(xiàn)信號(hào)增強(qiáng)，從而構(gòu)建一種靈敏檢測(cè)蛋白激酶活性的生物傳感器。Li等用AuNPs作信標(biāo)，利用共振光散射法對(duì)實(shí)際樣品不同細(xì)胞裂解液中蛋白激酶的活性進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)不同細(xì)胞的酶的活性表達(dá)水平進(jìn)行了比較。因?yàn)锳uNPs的共振光散射強(qiáng)度較弱，因此引入沉積的AgNPs可以增強(qiáng)檢測(cè)的信號(hào)強(qiáng)度，提高檢測(cè)靈敏度。
3。 2基于量子點(diǎn)
量子點(diǎn)是具有納米尺寸的半導(dǎo)體晶體，因具有獨(dú)特的光學(xué)、電學(xué)和電化學(xué)性質(zhì)，目前己成為生物識(shí)別和生物傳感過程中一類理想材料。基于QDs的發(fā)射波長(zhǎng)可隨其尺寸和形態(tài)自由調(diào)整的特點(diǎn)，可將其作為熒光探針應(yīng)用于DNA檢測(cè)、免疫分析、蛋白質(zhì)分析尤其是蛋白激酶活性分析。
設(shè)計(jì)了一種基于量子點(diǎn)一蛋白質(zhì)的生物扼合物，利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移的方法檢測(cè)蛋白激酶活性。其中，受體修飾在抗磷酸化膚的抗體上，量子點(diǎn)作為熒光能量轉(zhuǎn)移的供體，當(dāng)膚段發(fā)生磷酸化后，受體和供體便可近距離接觸，發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移，以增強(qiáng)受體熒光強(qiáng)度。在一定范圍內(nèi)，磷酸化的程度越高，在670 nm的熒光強(qiáng)度就越高。以上方法是利用量子點(diǎn)可作電子或能量的供體來實(shí)現(xiàn)蛋白激酶活性的靈敏檢測(cè)。但這些方法都需要將多膚束縛在量子點(diǎn)的表面以使得供體和受體盡可能靠近，以達(dá)到能量或電子轉(zhuǎn)移的目的，方法存在較大的局限性。
在電化學(xué)檢測(cè)方法上，基于QDs的信號(hào)放大在蛋白磷酸化分析中的應(yīng)用報(bào)道較少。Pin—wattan。等Cool設(shè)計(jì)了一種基于CdSe/ZnS QD、的電化學(xué)免疫傳感器，用于磷酸化的牛血清蛋白的分析檢測(cè)。在該夾心型免疫傳感中，QDs既用于電化學(xué)信號(hào)放大，又用于連接抗磷酸化絡(luò)氨酸抗體。另外，由于多種類型QDs具有電致發(fā)光的特性，表面可通過配位或聚合物修飾等方式連接有機(jī)分子或生物大分子，基于QDs的電化學(xué)發(fā)光生物傳感器有望成功應(yīng)用到蛋白磷酸化的分析中。但QDs屬于半導(dǎo)體材料，其導(dǎo)電性略差。
3。 3其它納米材料除了AuNPs和QDs之外，其它類型納米粒子在蛋白磷酸化分析中也有應(yīng)用。碳納米材料因其良好的導(dǎo)電性和大的比表面積可作為納米載體負(fù)載多酶、信標(biāo)等，也可很好地實(shí)現(xiàn)蛋白磷酸化分析的信號(hào)放大。Du等利用石墨烯氧化物（GO）作為納米載體負(fù)載大量的HRP和二抗，設(shè)計(jì)了一種新型的電化學(xué)免疫傳感用于磷酸化蛋白的超靈敏檢測(cè)。隨后，研制出一種基于石墨烯的電化學(xué)免疫傳感器。石墨烯作為傳感平臺(tái)不僅加快了電子傳遞而且增加了表面積以捕獲更多，導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度顯著增強(qiáng)。另外，Chen等基于Zr4+與磷酸根的強(qiáng)配位作用作為信號(hào)轉(zhuǎn)換器，利用磷酸根修飾的介孔硅包埋作為信號(hào)放大器，構(gòu)建了一種靈敏、簡(jiǎn)單、無標(biāo)記的電化學(xué)發(fā)光傳感器，用于蛋白激酶的活性分析。
4結(jié)論與展望
蛋白磷酸化分析經(jīng)過幾十年的發(fā)展，在靈敏檢測(cè)、選擇性富集方面取得了很大的進(jìn)展。本綜述在納米材料的富集方面主要涉及介孔納米材料、磁性納米材料和碳納米材料，分析了這些材料在磷酸化多膚或蛋白富集方面的優(yōu)缺點(diǎn)以及改進(jìn)之處。在基于納米材料的信號(hào)放大方面，主要涉及金屬納米粒子和量子點(diǎn)以及碳材料等。優(yōu)點(diǎn)是結(jié)合納米材料和信號(hào)放大技術(shù)可很好地實(shí)現(xiàn)蛋白激酶的快速、高靈敏和選擇性檢測(cè)。缺點(diǎn)是過程操作相對(duì)復(fù)雜、需多步組裝、在磷酸化的多膚和信號(hào)放大部分經(jīng)常需要加入額外的鏈接劑（如抗原抗體、生物素親和素以及親和性的金屬離子或氧化物）。
在未來的研究中可能主要圍繞以下方面開展：
①除了常見的電化學(xué)方法、質(zhì)譜法、熒光法外，還可以嘗試運(yùn)用新的方法檢測(cè)蛋白激酶活性（如光電化學(xué)法）。因?yàn)榱孔狱c(diǎn)均具有發(fā)光特性，在合適的激發(fā)光的刺激下發(fā)生躍遷可產(chǎn)生電流Coal，在磷酸化分析方面存在潛在的應(yīng)用。
�、谀壳�，雖然對(duì)于蛋白磷酸化的研究層出不窮，但實(shí)際應(yīng)用卻比較少，因此，致力于實(shí)際樣品的檢測(cè)應(yīng)是今后的努力方向。
�、蹖ふ倚碌牟牧�。尤其是具有選擇性識(shí)別或捕獲磷酸化膚或蛋白的納米材料，以簡(jiǎn)化蛋白磷酸化分析的過程。例如，目前最新發(fā)展起來的MOFs材料在磷酸化分析方面很有應(yīng)用價(jià)值，因?yàn)槠浔旧淼慕饘匐x子可識(shí)別磷酸化的多膚，而孔洞結(jié)構(gòu)、大的比表面積以及易于修飾的能力使得該材料可以作為信號(hào)放大的良好載體或是作為富集器，在復(fù)雜生物體中選擇性富集磷酸化多膚。
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